研究概要

１．はじめに

　動物にとって摂食行動は、生命維持と個体の諸活動を支えるエネルギー獲得のため、欠くことのできない最も重要な本能行動です。脊椎動物において、間脳の視床下部領域は体内外の情報を収集・統合して摂食調節に重要な役割を演ずる中枢として機能すると考えられています。ラットやマウスにおける最近の研究成果によれば、摂食行動は、視床下部を中心とした脳各領域に発現・分布する多数の神経ペプチドおよびモノアミン・カテコラミン作動性ニューロン群の協調あるいは拮抗作用によって促進的あるいは抑制的に制御されていることが判明してきました。例えば、空腹時には、オレキシン、グレリン、神経ペプチドYおよびメラニン凝集ホルモンなどの摂食亢進性の神経ペプチド作動性ニューロン群が興奮して摂食行動を誘発します。一方、満腹時には、コルチコトロピン放出ホルモン、a-黒色素胞刺激ホルモン、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチドおよび血管作動性腸ポリペプチドなどの摂食を抑制する神経ペプチド作動性ニューロン群によって、摂食を抑制します。また、これらの神経ペプチド作動性ニューロン群は相互作用しながら、摂食行動を制御・最適化することも判ってきました。さらには摂食行動を調節する神経ペプチドは生殖行動や情動行動にも深く影響を与える可能性が、最近、指摘され始めました。ラットやマウスなどのげっ歯類や他の哺乳類において摂食は、このように多数の神経ペプチドの中枢作用により調節されると考えられています。一方、鳥類のニワトリ（ヒナ）における神経ペプチドによる摂食制御機構は、げっ歯類の機構とかなり異なっていることも見出されてきました。例えば、九州大学の古瀬と橘らのグループによる脳室内投与実験によると、オレキシンとメラニン凝集ホルモンには摂食亢進効果は認められず、また、グレリンは摂食を強く抑制します。しかしながら、摂食行動の複雑な調節を司る脳神経機構の進化の過程における変遷については、全く判っていません。そこで、我々の研究グループは魚類の摂食制御機構の解明を目指し、諸々の生理学的知見の蓄積がありモデル動物として多用されているキンギョ（Carassius auratus）を使って神経ペプチドによる摂食行動の脳制御機構の解析を進めています。本特集では、現在進行形の研究ではありますが、これまでに得られた知見を概説します。なお、本特集に登場する種々の神経ペプチドについては、日本比較内分泌学会編「ホルモンハンドブック新訂eBook版」（南江堂より出版）に詳細が記載されておりますので是非ご参照ください。

２．キンギョの摂食行動を制御する神経ペプチドの機能解析

　げっ歯類より見出されてきた摂食の調節に関わる神経ペプチドおよび受容体のほとんどはキンギョの脳にも存在することがペプチドの単離・精製、cDNAのクローニングと遺伝子同定、PCR法、in situハイブリダイゼーション組織化学法および神経ペプチド特異的な抗体による免疫組織化学法等で明らかにされています。我々のグループは、Prof. Richard Ector Peterがキンギョの脳アトラス作成時に使用した脳固定器を応用して考案した脳室内投与法および給餌した餌の残存量より容易に摂食量を求める計測法などの実験法確立により、これらの神経ペプチドを投与すると摂餌量が顕著に変動することを見出しました。また、神経ペプチドをコードする前駆体mRNAあるいは、それぞれの神経ペプチドに対する受容体をコードするmRNAの脳内発現量が給餌状態により大きな影響を受けることも判りました。例えば、オレキシン、グレリンおよび神経ペプチドYの脳室内投与により、キンギョの摂食量は有意に増加します。一方、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド、血管作動性腸ポリペプチド、コルチコトロピン放出ホルモン、a-黒色素胞刺激ホルモン、ジアゼパム結合阻害物質由来ペプチドおよびニューロメディンUなどの脳室内投与は、キンギョの摂食量の低下を引き起こします。また、これら神経ペプチドmRNA発現に及ぼす摂餌状態の影響を探ったところ、食欲亢進性神経ペプチドmRNAレベルは絶食により増大し、食欲抑制性神経ペプチドmRNAレベルは絶食状態で減少あるいは過食状態で増加することが判りました。キンギョにおけるこれらの実験結果は、魚類の摂食がげっ歯類と類似している神経ペプチド作動性の神経伝達機構により調節されていることを示唆しています。しかしながら、例えばメラニン凝集ホルモンの場合のように、げっ歯類と異なる機構の存在も見出されてきました。すなわち、メラニン凝集ホルモンは、げっ歯類において摂食を促す作用を示す代表的な摂食亢進性神経ペプチドとして位置づけられていますが、キンギョでは、メラニン凝集ホルモンは、摂食を抑制する脳内因子として機能することを明らかにしました。以下に主な神経ペプチドの先行研究の知見や解析結果を紹介します。

２－１．摂食亢進性神経ペプチド

２－１－１．オレキシン
　オレキシンは1998年に桜井と柳沢らによりオーファン受容体ストラテジーによるリガンド追跡の結果発見されたペプチドであり、発見当初より摂食行動の亢進活性を有することからオレキシンと名付けられました。現在、哺乳類におけるオレキシンの機能解析は非常に伸展しており、オレキシンは、摂食亢進による生体エネルギーの確保や脳内リズムの伝播およびそれに基づく睡眠－覚醒サイクルの制御に携わる多機能性神経ペプチドと考えられています。魚類におけるオレキシンの機能に関する報告は、多くありませんが、ゼブラフィッシュにおいてオレキシンあるいはオレキシン受容体遺伝子の改変は、遊泳活動量に影響を与えることが示されており、哺乳類のような脳内リズムの伝播制御に関わっている可能性が示唆されています。摂食行動への影響については、キンギョにおいて絶食状態では脳内オレキシンmRNAレベルは上昇し、オレキシンを脳室内投与すると摂餌量が高まり、オレキシン抗体の投与により低下することから摂食亢進性作用を有するものと考えられます。また、グルコース負荷をかけると摂食量の低下と視床下部オレキシンニューロンの免疫染色強度の減弱が観察されることから、血中グルコースへの感受性も示唆されます。

２－１－２．グレリン
　グレリンは1999年に児島と寒川らにより発見されたペプチドです。グレリンによる摂食調節に関する研究も哺乳類において多数報告されており、グレリンの第一義的な機能は、生体へのエネルギー取り込み（摂食亢進）と保持（基礎代謝の維持）および成長促進であると考えられています。海谷らによって精力的に魚類グレリンの単離・精製と特徴付けが進められた結果、幾つかの分子種が同定されています。キンギョにおいてグレリンの脳室内投与は摂食量を高めますが、脂肪酸修飾を受けていないグレリンにはこの活性はありません。また、興味深いことに脂肪酸修飾のないグレリンはグレリンによる摂食亢進作用を機能的に抑制しますが、その実体は不明です。キンギョにおいてグレリンmRNAの発現は小腸で最も高いのですが、腹腔内へのグレリン投与は、脳内投与と同様に摂食量を高めます。この作用はげっ歯類のように求心性神経経路を辿って脳へ入力することを示唆するデータを得ましたが、直接、脳へ到達する可能性も考えられます。

２－１－３．神経ペプチドY
　神経ペプチドYは、立元らにより発見されたペプチドです。その後、様々な動物種より単離・同定された結果、一次構造が非常に保存されており、様々な中枢・末梢作用を有する重要な神経ペプチドのひとつと考えられています。特に、情動行動や生殖行動の調節に深く関わることがげっ歯類を用いた研究により見出されています。また、摂食行動を非常に強く促すことから、オレキシンやグレリンと同様に代表的な摂食亢進性ペプチドのひとつとして位置づけられています。キンギョにおいても神経ペプチドYの脳室内投与は摂餌量を高めることが報告され、この摂食亢進作用は主にY1あるいはY5受容体経路によるものであることが示されています。

２－１－４．メラニン凝集ホルモン
　メラニン凝集ホルモンは、1983年に川内らによって魚類より初めて見出された体色調節に関与する視床下部ホルモンであることは、言うまでもなく皆様よくご存知のことと思います。哺乳類の脳内にもメラニン凝集ホルモンの存在が証明されてきたものの、体色変化に関与するとの報告はありません。ところが、神経ペプチドによる摂食行動の中枢性制御機構の存在やレプチンによる摂食抑制作用が注目されはじめた1990年代にメラニン凝集ホルモンと肥満や病的な過剰摂食との密接な関係を示す報告がなされ、現在では、オレキシンやグレリンと同様に、摂食とエネルギーバランスの維持に働く重要な神経ペプチドとして位置づけられています。ニワトリ（ヒナ）において、メラニン凝集ホルモンの脳室内投与は、摂食行動に何も影響を与えないことが示されています。一方、魚類における、体色調節以外の作用は永らく不明のままでした。魚類の摂食調節に関する総説の中には、メラニン凝集ホルモンは摂食行動には重要な役割を担っていないとまで記述されるほど調べられていませんでした。そこで、我々の研究グループは脳室内投与実験を行い、摂餌量に及ぼす影響を調べました。すると魚類由来のメラニン凝集ホルモンも哺乳類由来のメラニン凝集ホルモンもキンギョの摂餌を顕著に抑えるデータを得ました。メラニン凝集ホルモンは、キンギョでも摂食調節に関与するものの、げっ歯類とは逆に摂食抑制作用を有する可能性が示唆されました。

２－２．摂食抑制性神経ペプチド

２－２－１．下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド
　下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチドは、1989年に宮田と有村らによって下垂体刺激作用を有する視床下部ホルモンとして発見された神経ペプチドです。下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチドは、腺性下垂体細胞の細胞内伝達機構の駆動の有無により探索された、オーファン受容体ストラテジーの魁ともいえる実験手法により見出されました。下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチドは視床下部のみならず、体内各所に発現し、その受容体分布も広いことから、多機能性ペプチドとして捉えられています。しかしながら、ハウスキーパー的な機能が多く、神経幹細胞の分化・誘導、神経細胞死抑制など次々と新たな機能が見出されています。下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチドの中枢作用も未だに不明な点が多いのですが、脳室内投与すると摂食量が減少することが報告されています。キンギョにおいても、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチドの脳室内投与は摂食を抑制することが判りました。興味深いことに一次構造の類似する血管作動性腸ポリペプチドの投与も摂食を抑制します。ニワトリ（ヒナ）でも摂食を抑制しますが、げっ歯類では血管作動性腸ポリペプチドの投与は無効であることが最近報告されました。

２－２－２．コルチコトロピン放出ホルモン
　コルチコトロピン放出ホルモンは、Valeらにより視床下部ホルモンとして見出された神経ペプチドです。言うまでもなくコルチコトロピン放出ホルモンは、視床下部－下垂体－副腎系の要としてグルココルチコイド分泌を調節するストレスホルモンとして位置づけられています。一方、脳内には構造の類似したウロコルチン類が見出されており、中枢性にもストレスホルモンとして機能します。また、これらには強い摂食抑制作用があります。キンギョにおいて、コルチコトロピン放出ホルモンの脳室内投与はげっ歯類と同様に中枢性に摂食行動を抑えます。

２－２－３．a-黒色素胞刺激ホルモン
　a-黒色素胞刺激ホルモンは、下垂体中葉ホルモンとしてよく知られています。a-黒色素胞刺激ホルモンは中枢性に様々な機能も発揮しており、摂食行動、学習、性行動や情動行動などに関与することが知られています。キンギョにおいて、a-黒色素胞刺激ホルモンの脳室内投与は、強い摂食抑制を引き起こしますが、この抑制効果はメラノコルチン4型受容体を介して起こります。興味深いことに哺乳類ではアグーチ関連ペプチドは内因性のアンタゴニストとして働き、摂食を亢進させます。また、アグーチ関連ペプチドと神経ペプチドＹは同一の神経細胞に共存することが知られています。

２－２－４．メラニン凝集ホルモン
　前項２－１－４で述べたとおり、キンギョにおいては、メラニン凝集ホルモンは摂食抑制因子として機能します。しかしながら、他の魚種、例えばマツカワでは摂食亢進作用を示唆するデータも報告されており、メラニン凝集ホルモンの魚類における作用は一様ではないのかもしれません。次の項では、キンギョにおけるメラニン凝集ホルモンも含めた神経ペプチドによる摂食制御の作用機序について説明します。

３．キンギョの摂食を制御する神経ペプチドの作用機序の解析　

　これまで述べてきたように種々の神経ペプチドはキンギョの摂食行動に影響を与えることが判明してきました。しかしながら、キンギョの摂食を制御するニューロンの特定や神経回路網、さらには行動発現に至る情報伝達機構についてはほとんど判っていません。そこで、摂食亢進性ペプチドのオレキシン、グレリンおよび神経ペプチドYの情報伝達機構と、摂食抑制性ペプチドの下垂体アデニル酸シグラーゼ活性化ポリペプチド、コルチコトロピン放出ホルモン、a-黒色素胞刺激ホルモンおよびメラニン凝集ホルモンによるシグナル伝達経路について解析しました（図1）。

３－１．摂食亢進性神経ペプチドのシグナル伝達経路
　キンギョにおいてグレリンmRNAは、リアルタイムPCR法を用いて探ると消化管など内臓諸器官に多く発現しています。また、グレリンを腹腔内に投与してもキンギョの摂食は強く刺激されます。そこで、腹腔内へ投与したグレリンのシグナル伝達経路について調べたところ、グレリンのシグナルはカプサイシン感受性の迷走神経系あるいは内臓神経系の求心路を経て脳へ到達することが判りました。さらに、脳室内あるいは腹腔内投与したグレリンのシグナル伝達は、神経ペプチドYのY1受容体アンタゴニストのBIBP3226の前処置により消失したり、オレキシン1型受容体アンタゴニストのSB334867の前処置によっても消失したりしました。従って、キンギョにおいてグレリンは、最終的には中枢神経系の神経ペプチドYとオレキシンによる作用経路を介して摂食亢進作用を発揮することが明らかになりました。また、興味深いことに、オレキシンと神経ペプチドYの摂食亢進作用は、お互いのアンタゴニスト投与で消失したり、オレキシンの作用はグレリン受容体のGHS 1a型受容体アンタゴニストの[D-Lys3]-GHRP-6によりブロックされたりします。これらの結果の総合的な解釈は難しいのですが、これら三者の神経ペプチドはすべての役者がそろってはじめて摂食亢進作用を発揮するのかもしれません。

３－２．摂食抑制性神経ペプチドのシグナル伝達経路
　下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチドによる摂食抑制作用についても同様な薬理学的な解析により検討しました。下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチドの投与による抑制効果は、コルチコトロピン放出ホルモン1型および2型受容体の非選択的アンタゴニストであるa-helical CRH(9-41)により抑制されますが、a-黒色素胞刺激ホルモン受容体のひとつであるメラノコルチン4型受容体に対するアンタゴニストのHS024の投与には影響されないことが判りました24）。下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチドの摂食抑制作用は、コルチコトロピン放出ホルモン作動性ニューロンおよびコルチコトロピン放出ホルモン受容体経路を介する摂食抑制経路を通ることが示唆されました。ニワトリ（ヒナ）もキンギョの作用機構と類似していますが、一方、げっ歯類では下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチドの摂食抑制作用は、a-黒色素胞刺激ホルモン作動性ニューロンを介することが示されています。私たちの研究グループは、先ほど述べたとおり、キンギョではメラニン凝集ホルモンの脳室内投与が摂食抑制を引き起こすことを明らかにしましたが、その作用経路を探ったところ、興味深いことに下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチドの抑制作用経路の場合とは異なり、コルチコトロピン放出ホルモン受容体経路を通るのではなく、メラノコルチン4受容体経路を経由することを見出しました。薬理学的解析によりキンギョにおけるメラニン凝集ホルモンの摂食制御機構は、げっ歯類の機構と大きく異なることが示唆されました（図2）。また、キンギョにおいて、摂食抑制経路は、コルチコトロピン放出ホルモンを介する経路とa-黒色素胞刺激ホルモンを介する経路の2つのシグナル伝達経路より構成されている可能性が示唆されました。

３－３．摂食亢進性神経ペプチドと摂食抑制性神経ペプチドとの拮抗作用
　キンギョにおいて、神経ペプチド間の相互作用における摂食亢進と摂食抑制の拮抗については、ほとんど研究が進んでいません。断片的な結果としては、メラニン凝集ホルモンの脳室内投与は、グレリンと神経ペプチドYのmRNA発現を強く抑えることが判りました（図2）。恐らくメラニン凝集ホルモンはメラノコルチンシステムを介して、さらには摂食亢進性のグレリンと神経ペプチドYの新規合成を阻害しながら摂食抑制作用を発揮すると考えられます。他の神経ペプチド間の拮抗作用の存在も予想されますが、現在のところ、よく判っていません。

４．キンギョの摂食行動を司る中枢の同定

　1970年代には既にキンギョの脳アトラス（地図）作製と脳機能の解析が進められていました。特に脳の局所的な破壊実験や電気刺激実験の結果によると、間脳視床下部の内側領域や後側領域が摂食行動の発現と制御に重要であることが示されていました。我々のグループによる免疫組織化学的観察では、例えばオレキシン含有神経細胞体は主に視床下部の特定領域（第3脳室側部の背内側領域）に位置することを突き止めました。ここに位置するオレキシン含有神経細胞体は絶食により高発現すること、グルコース負荷により減弱することが判りました。一方、メラニン凝集ホルモン含有ニューロンでは、同領域に発現する少数の神経細胞体が絶食により減弱することを観察しました。これらのことと1970年代に得られていた先行知見とを考え合わせると、キンギョの摂食を亢進する中枢と抑制する中枢は混在して第３脳室側部の背内側領域付近に存在することが強く示唆されました。また、これらの領域において、メラニン凝集ホルモン含有神経線維と神経ペプチドY含有神経細胞体あるいはa-黒色素胞刺激ホルモン含有神経細胞体が非常に近接して存在する組織像を共焦点レーザ走査顕微鏡による二重免疫蛍光観察で得ており、先に述べたメラニン凝集ホルモンの作用機序を支持することが強く示唆されました。今後、他の神経ペプチド含有ニューロンの脳内分布やこれらのニューロン群の神経回路網について機能形態学的に探る必要があります。